Ik heb het eerder gehad over het bestuderen van de functie van genen met RNAi.

Echter, wanneer we de functie van een gen willen bestuderen dan moeten we er wel eerst voor zorgen dat we genoeg kopieën van dat gen hebben om te bestuderen. In ieder genoom zitten 2 kopieën van ieder gen, 1 zit op het chromosoom van je moeder en 1 op het chromosoom van je vader (zie DNA, RNA en eiwit). Dit is helaas niet genoeg om het gen te kunnen bestuderen en daarom willen we graag het aantal exemplaren van ons gen van interesse kunnen vermeerderen. Het is wel mogelijk om DNA te laten maken door een bedrijf, maar dit geeft alleen betrouwbaar  DNA wanneer het niet langer is dan 30 basen (combinatie van 30 maal een A,T,C en G). Dat is jammer, maar gelukkig kunnen we een enzym dat in een bacterie DNA maakt (polymerase) gebruiken om het werk voor ons te doen. Deze methode om DNA te vermeerderen heet de polymerase-kettingreactie (PCR). Wanneer we DNA willen vermeerderen hebben we dus startmateriaal nodig. Dit wordt uit het originele weefsel gehaald waar we interesse in hebben, dus in mijn onderzoek haal ik DNA uit de eieren van de meelkever. De polymerase heeft dit DNA nodig als voorbeeld om te kopiëren. Buiten een voorbeeld heeft de polymerase ook een beginnetje nodig, dit noemen we de primers.




Primers

Primers zijn korte stukjes DNA van vaak rond de 20 basen. Deze zoeken we zo uit dat ze precies op ons DNA van interesse passen. Als we het DNA verhitten tot 95 graden dan valt het dubbelstrengs DNA uiteen in een 5’ (5 accent) enkelstrengs DNA en een 3’ (3 accent) enkelstrengs DNA (denaturatie). We hebben om DNA te vermeerderen 2 verschillende primers nodig, een voor de 5’en een voor de 3’ DNA streng. Deze primers binden op enkelstrengs DNA waardoor een kort stukje hiervan wel dubbelstrengs is. Dit geeft de polymerase een startplek om met het kopieren te beginnen (zie onderstaande figuur). De primers bepalen hoe specifiek we DNA kopieren, als we ze goed ontwerpen dan past een primer maar op 1 gen en zullen we alleen dat gen vermeerderen.

Primer
De kettingreactie

Om de kettingreactie goed te laten verlopen zorgen we dus dat we het startmateriaal hebben, het DNA. Verder zorgen we ervoor dat we ook voldoende losse basen in de oplossing hebben zitten om DNA van te maken (A,T,G en C), de primers gaan erin en niet te vergeten de polymerase. Het kopieren van DNA gaat in 3 stappen.

Stap 1) Het dubbelstrengs DNA wordt op ongeveer 95 graden opgesplitst in 2 enkelstrengs DNAs (Denaturatie).

Stap 2) Afkoelen tot ongeveer 60 graden, bij deze temperatuur kunnen de primers zich binden aan het enkelstrengs DNA (Hybridizatie).

Stap 3) Bij ongeveer 72 graden wordt het DNA verlengd vanaf de primers door de polymerase (Vervollediging).
Door deze reactie zijn er 2 keer zoveel kopieën van het DNA in de oplossing. Door deze drie stappen te herhalen krijgen we 2 keer zoveel van ons DNA van interesse in de oplossing in iedere ronde (zie onderstaande figuur).

PCR
Dus met PCR vermeerderen we het DNA exponentieel. Vaak worden deze stappen rond de 30 keer herhaald waardoor er ontzettend veel van het benodigde DNA aanwezig is, terwijl al het overige DNA niet gekopieërd is en dus in lage hoeveelheden aanwezig is. Uiteindelijk raken de grondstoffen (primers en basen) op en dit zorgt ervoor dat de exponentiele groei geremd wordt en we een s-vormige curve krijgen als we kijken naar de hoeveelheid van ons DNA. In de onderstaande grafiek zie je een curve, het aantal rondes staat op de x-as en de hoeveelheid DNA op de y-as.

Amplification
Het vermeerderde DNA kunnen we controleren op gel en we kunnen dit gebruiken om met behulp van andere technieken zoals RNAi de functie van dit gen te achterhalen.

Geef een reactie