Ik heb hier de theorie van RNA interferentie besproken. In het kort zorgen we met RNA interferentie ervoor dat een gen uitgeschakeld wordt door dubbelstrengs RNA te injecteren. Hier laat ik zien hoe we dit dubbelstrengs RNA injecteren in Tribolium. We injecteren het RNA in de poppen omdat deze makkelijk handelbaar zijn. Het is echter ook mogelijk het RNA te injecteren in de eieren, larven of volwassenen.




Eerst verzamelen we de poppen, dit doen we door ze uit het meel te zeven. We zoeken poppen die bijna klaar zijn met ontwikkelen. Deze kunnen we herkennen aan hun donkere vleugels en donkere monddelen (rode pijlen). Dan sorteren we de mannetjes poppen van de vrouwtjes poppen. Dit doen we omdat alleen de vrouwtjes eieren leggen en we geïnteresseerd zijn in de functie van een gen in het ei.

2013-01-08 16.24.22 2013-01-08 16.56.05
Omdat we alleen de vrouwtjes willen injecteren gaan we de poppen sorteren op geslacht. Dit kunnen we doen door naar de genitaliën te kijken, vrouwtjes hebben 2 lobben en mannetjes hebben deze niet (zie onderstaande figuur, lobben zijn in het zwart/wit figuur oranje).

poppensexen
Nadat we de vrouwtjespoppen hebben gesorteerd gaan we ze opplakken op een microscoopglaasje.

2013-01-08 16.55.11
Vervolgens zuigen we het dubbelstrengs RNA (gekleurd met vitaal rood) op in een naald:

2013-01-08 16.54.41
Dit injecteren we in de poppen onder een microscoop:

2013-01-08 16.59.14 2013-01-08 16.59.25
Wanneer we hiermee klaar zijn, stoppen we de microscoopglaasjes schuin in het meel. Zodra de poppen uitkomen vallen de kevers in het meel. De losse poppen die erbij liggen zijn de mannetjes, die zijn ongeïnjecteerd erbij gestopt om de vrouwtjes te bevruchten.

2013-01-08 17.17.47
In zowel de vrouwtjes die we hebben geïnjecteerd als in de eieren die ze leggen, is het gen nu uitgeschakeld. We kunnen nu dus onderzoeken wat de functie van dit gen is. Hieronder nog een kort filmpje over RNA interferentie in Tribolium.

Geef een reactie